El aprendizaje automático discrimina P2X7
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El aprendizaje automático discrimina P2X7

Aug 09, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12673 (2023) Citar este artículo

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El trifosfato de adenosina (ATP) es una molécula de señalización extracelular que afecta principalmente la situación fisiopatológica del cuerpo y puede ser detectada por receptores purinérgicos, incluido el ionotrópico P2X7. Las células madre neuronales (NSC) permanecen en los tejidos neuronales adultos y pueden contribuir a procesos fisiológicos mediante la activación por situaciones fisiopatológicas evocadas. En este estudio, revelamos que las NSC derivadas de células madre pluripotentes (iNSC) inducidas por humanos tienen capacidad de detección de ATP principalmente a través del receptor purinérgico e ionotrópico P2X7. A continuación, para desarrollar un sistema de detección basado en aprendizaje automático (ML) para sustancias neuronales efectivas derivadas de alimentos y sus dosis efectivas, recopilamos respuestas de calcio desencadenadas por ATP de iNSC pretratadas con varias sustancias y dosis. Finalmente, descubrimos que el ML se realizó utilizando imágenes compuestas, cada una de las cuales contenía nueve imágenes de formas de onda, para lograr un mejor modelo de ML (MLM) con mayor precisión. Nuestro MLM puede clasificar correctamente cambios sutiles no identificados en las formas de onda producidas por iNSC pretratadas con cada sustancia y/o dosis en el grupo positivo, con cambios comunes en la expresión del ARNm que pertenecen a las firmas de ontología genética.

Se sabe que el cerebro es el órgano más complejo y flexible del cuerpo. El desarrollo de la red neuronal dentro del cerebro fetal tiende a verse afectado por sustancias químicas que atraviesan la barrera placentaria1,2. Después del nacimiento, el cerebro humano continúa creciendo y desarrollando redes neuronales funcionales que reciben estimulación externa como información significativa. Sin embargo, la exposición posnatal a sustancias neurotóxicas como el bifenilo policlorado puede tener efectos negativos en el desarrollo mental y motor3. Incluso en el cerebro adulto, es necesario mantener las redes neuronales esenciales establecidas y desarrollar nuevas redes hasta la muerte4. Estudios recientes han revelado que el cerebro humano adulto contiene células madre neurales (NSC) para la neurogénesis de novo para la regeneración y/o el establecimiento de nuevas redes5. Para mantener el equilibrio entre la homeostasis y los cambios en las redes neuronales, es necesario estudiar las dosis neuronales efectivas de las sustancias que ingresan al cuerpo.

Los alimentos y las bebidas son las fuentes más comunes de nutrientes y sustancias neuronales, incluidas las neurotoxinas6. En los países industrializados modernos, están entrando al mercado varios alimentos y suplementos nuevos con malas experiencias de consumo. Por ejemplo, los suplementos adelgazantes que contienen sibutramina pueden provocar graves problemas de salud7. Además de las neurotoxinas puras, es importante conocer las dosis efectivas de los alimentos diarios que contienen sustancias que afectan a las neuronas como la cafeína, el alcohol y la teanina.

Los efectos neuronales se han probado principalmente en animales. Sin embargo, para abordar las preocupaciones sobre el bienestar animal, se deben desarrollar métodos alternativos para predecir la neurotoxicidad. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son un recurso ideal para los sistemas de detección toxicológica porque pueden proporcionar varios tipos de células neuronales con menos problemas éticos. Muchos informes han demostrado que las neuronas derivadas de hiPSC son útiles para evaluar y caracterizar la neurotoxicidad de sustancias específicas relacionadas con la muerte celular o la sinaptogénesis8,9. Sin embargo, hasta la fecha, ningún sistema de detección puede segregar de forma dosis-dependiente sustancias generales que contienen alimentos en grupos con o sin efectos neuronales.

El trifosfato de adenosina (ATP) es el principal mensajero purinérgico que sirve como indicador de daño cerebral10. La concentración de ATP refleja la gravedad del daño, ya que las células dañadas liberan ATP de forma incontrolable. El ATP extracelular puede conducir a un ciclo de "daño inducido por daño" mediante la inducción de muerte celular neuronal directa y respuestas inflamatorias microgliales11. El ATP es detectado por receptores purinérgicos, de los cuales P2X7 se expresa ampliamente en células excitables, incluidas células progenitoras neuronales derivadas de células madre pluripotentes humanas, astrocitos, células similares a la microglía y neuronas12. Sin embargo, la funcionalidad de P2X7 en iNSC humanas aún no está clara.

P2X7 es un receptor ionotrópico. Cuando es activado por ATP, abre un canal catiónico más grande que impregna iones de potasio, sodio y calcio en lugar de otros subtipos13. Por lo tanto, se cree que P2X7 desempeña un papel importante en condiciones patológicas, como la muerte celular, la inflamación y las lesiones neuronales excitadoras. La activación ionotrópica de P2X7 en las neuronas provoca chispas de calcio con características de alta frecuencia, alta magnitud y corta duración, que se distinguen de las ondas de calcio característica y mecánicamente14. Las chispas de calcio pueden ser causadas por cambios en el potencial de membrana impulsados ​​por P2X7 que activan directamente los canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, seguidos de la activación de la liberación de calcio inducida por calcio desde el retículo endoplásmico mediante la activación del canal del receptor de rianodina.

El aprendizaje automático se ha utilizado ampliamente en el campo del diagnóstico médico. Sin embargo, su aplicación a los sistemas de detección toxicológica como sustituto de las pruebas in vitro e in vivo sigue siendo un desafío. Kowalczewski et al.15 informaron que un modelo de aprendizaje automático puede distinguir las respuestas de los cardiomiocitos derivados de hiPSC a agentes arritmogénicos representativos, isoproterenol, verapamilo y cisaprida, basándose en parámetros conocidos de ondas de calcio. Monzel et al.16 desarrollaron un modelo de aprendizaje automático que puede discriminar entre organoides neuronales derivados de hiPSC tratados con toxina dopaminérgica específica de neuronas 6-hidroxidopamina.

En este estudio, confirmamos que el P2X7 funcional se expresa en NSC derivadas de células madre pluripotentes (iNSC) inducidas por humanos e investigamos el efecto del pretratamiento con compuestos eficaces neuronales neurotóxicos y dependientes de la dosis mediante perfiles de expresión de ARNm global. A continuación, desarrollamos un modelo de aprendizaje automático (ML) utilizando imágenes de chispas de calcio sin procesar que contienen efectos potenciales indefinidos por tratamiento químico utilizando una nueva metodología. El modelo de ML desarrollado podría segregar con precisión los datos del grupo intratest en grupos con efecto neuronal o con efecto neuronal no o menos y predecir con éxito compuestos con efecto neuronal no educado como miembros del grupo de efecto neuronal.

Diseñamos todo el estudio, como se muestra en la Fig. 1. A partir de la literatura, determinamos concentraciones altamente efectivas como dosis altas y concentraciones menos efectivas como dosis bajas para las células neuronales17,18,19,20. Las concentraciones utilizadas para el tratamiento se enumeran en la Tabla 1.

Dibujo esquemático de todo el diseño y objetivo del estudio.

Confirmamos la diferenciación exitosa de hiPSC en iNSC detectando la expresión de Nestin, una proteína marcadora de células madre neuronales, en los niveles de ARNm y proteína (Fig. 2a). A continuación, confirmamos la expresión de P2X7 en los niveles de ARNm y proteína mediante PCR cuantitativa, transferencia Western y tinción por inmunofluorescencia (Fig. 2a, Fig. 1 complementaria). También confirmamos que las iNSC expresan otros ARNm de receptores purinérgicos en las familias P2X y P2Y (Figura complementaria 2). La chispa de calcio inducida por el ATP se inhibió completamente mediante la adición de Brilliant Blue G (BBG) 20 μM, un antagonista específico de P2X721,22,23,24 (Fig. 2b, Películas complementarias 1 y 2). Observamos una reducción de aproximadamente el 83 % en el número de células que responden al calcio y una reducción de aproximadamente el 83 % en la frecuencia con BBG (Fig. 2B). Tenga en cuenta que debido al bloqueo de la señal ionotrópica de P2X7 por parte de BBG, solo se detectaron ondas de calcio. Además, confirmamos la importancia de P2X7 en las chispas de calcio inducidas por ATP utilizando otro antagonista específico de P2X7, JNJ-4796556712,25,26, y un inhibidor, AZD905627 (Figura complementaria 3).

Confirmación de la expresión de P2X7 funcional en iNSC. ( a ) Confirmación de la expresión de Nestin y P2X7 a nivel de ARNm y proteína. Barras de escala, 100 μm; y un recuadro de 30 μm. (b) Efecto inhibidor del antagonista específico de P2X7 Brilliant Blue G sobre las chispas de calcio inducidas por ATP. Se muestran chispas de calcio representativas de las cuatro células. La fracción celular de células con respuesta positiva al calcio y sus frecuencias de señal se muestran en gráficos de barras.

Seleccionamos la cafeína de forma dependiente de la dosis como una sustancia neuronalmente eficaz conocida. Se seleccionó el ácido valproico como sustancia neuronal fuerte representativa. Además, analizamos los efectos del haloperidol en la expresión genética global y la secuenciación del ARN de próxima generación reveló que cada tratamiento tenía una característica de expresión (Fig. 3a). Observamos tanto una regulación positiva como una regulación negativa de los genes en todas las comparaciones en comparación con el control (Fig. 3b). Las listas de genes con cambios de expresión de más de 5 log2 veces en cada comparación se muestran en la Tabla complementaria 1a, b. Tenga en cuenta que no hubo diferencias obvias en la cantidad de genes modificados entre los tratamientos con bajo y alto contenido de cafeína. Sin embargo, a través del análisis de enriquecimiento estadístico de ontología genética (GO), encontramos que las categorías de "actividad de transporte transmembrana pasiva" y "actividad del canal" cambiaban comúnmente en todos los grupos positivos, pero no en el grupo de dosis bajas de cafeína (Fig. 3c). .

Cambios en la expresión genética y firmas comunes en el grupo positivo. ( a ) Mapa de calor de la expresión génica en iNSC tratadas con nada (naranja), cafeína baja (rosa), cafeína alta (azul), ácido valproico (verde) y haloperidol (amarillo). (b) Gráficos de volcán de genes expresados ​​diferencialmente en RNA-seq en comparación con ninguno versus cafeína baja, cafeína alta, ácido valproico y haloperidol. (c) Diagrama de análisis de enriquecimiento de ontología genética. Factor rico: la relación entre el número de genes diana dividido por el número de todos los genes en cada término Padj: valor de p con múltiples correcciones de prueba.

Primero obtuvimos las colecciones de formas de onda individuales 1162 o 1034 seleccionadas de las reservas de formas de onda obtenidas del grupo negativo o positivo (excepto las formas de onda del tratamiento con haloperidol). A continuación, demostramos cada ML mediante cada forma de onda de 1970 seleccionada al azar de los stocks de formas de onda. Para evaluar el MLM desarrollado, probamos la precisión y la recuperación utilizando 226 nuevas formas de onda seleccionadas al azar del stock. Como resultado, obtuvimos aproximadamente un 81% de precisión promedio (Fig. 4a). A continuación, para garantizar que ML se centre en diferencias significativas sin selección de datos humanos, combinamos nueve formas de onda seleccionadas al azar (no se consideran las reutilizaciones de imágenes) de cada grupo en una imagen compuesta y luego demostramos ML utilizando 1162 imágenes compuestas. Como resultado, obtuvimos una precisión promedio de aproximadamente el 99% (Fig. 4b). Además, para confirmar la aplicabilidad potencial de este MLM (llamado MLM-1), desafiamos las formas de onda de calcio tratadas con haloperidol no educadas y descubrimos que el 74% de las formas de onda podían segregarse en el grupo positivo (Fig. 4c). Además de investigar la amplitud de la aplicabilidad del MLM-1, tratamos ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido gamma-aminobutírico (GABA) a iNSC recién preparadas a partir del stock congelado y obtuvimos sus formas de onda de calcio. El MLM-1 logró segregar el GABA en el grupo positivo, pero no logró hacer la predicción correcta para el DHA (datos no mostrados). Para investigar la dependencia de los lotes de células de los MLM, realizamos una prueba de predicción cruzada desafiando las formas de onda obtenidas previamente de diferentes lotes de iNSC derivadas de las mismas existencias maestras y descubrimos que MLM-1 no logró segregar correctamente algunas de las formas de onda (datos no mostrados). . A continuación, cultivamos iNSC recientemente a partir de reservas maestras, obtuvimos todas las sustancias y formas de onda tratadas con dosis y realizamos un nuevo ML con imágenes compuestas. Este nuevo MLM (llamado MLM-2) logró aproximadamente un 89% de precisión promedio y logró segregar formas de onda no educadas con haloperidol y tratadas con DHA en el grupo positivo con una precisión de 85% y 59%, respectivamente; sin embargo, falló en el caso de GABA (segregó solo el 23% de las formas de onda en el grupo positivo) (Figura complementaria 4). Además de investigar si ML discrimina el reconocimiento de parámetros generales, realizamos análisis estadísticos de formas de onda comparando grupos negativos y positivos con respecto a la frecuencia de pico y el rango dinámico. No pudimos encontrar diferencias significativas en estos parámetros (Figuras complementarias 5a, b). Además, para obtener información mecanicista sobre la alta capacidad de detección de nuestro nuevo método ML, realizamos ML utilizando formas de onda de señal débil seleccionadas intensivamente. El MLM-3 desarrollado con formas de onda 703 únicas no mostró superioridad sobre el MLM desarrollado con formas de onda no seleccionadas (Figura complementaria 6a). Por el contrario, MLM-3 desarrollado utilizando 703 imágenes compuestas con la forma de onda de señal débil seleccionada dio como resultado mejores precisiones promedio que el caso de MLM-1 desarrollado mediante imágenes compuestas utilizando formas de onda no seleccionadas (Figura complementaria 6b). Para caracterizar aún más nuestro nuevo método ML, realizamos ML utilizando la misma cantidad de formas de onda en imágenes de formas de onda simples y compuestas. Obtuvimos precisiones promedio similares de 0,829 y 0,809, respectivamente (Figura complementaria 7).

Los efectos de la nueva metodología de aprendizaje automático (ML). (a) Los ML se realizaron utilizando una imagen de forma de onda única para el entrenamiento. (b) Los ML se realizaron utilizando imágenes compuestas (nueve formas de onda en una imagen) para educación. (c) Predicción del haloperidol como nueva sustancia que pertenece al grupo de actividad neuronal positiva.

Este informe confirmó la actividad de transducción de señales de calcio a través de P2X7 expresada en iNSC humanas. La importancia fisiológica de P2X7 en NSC in vivo actualmente no está suficientemente caracterizada; sin embargo, nuestras observaciones muestran que las iNSC tratadas con ATP mostraron un crecimiento acelerado y el tratamiento con Brilliant Blue G perjudicó este crecimiento (datos no mostrados), similar a lo que se ha informado en las células tumorales. En conjunto, las NSC pueden controlar su crecimiento detectando condiciones patológicas28. Por el contrario, las neuronas maduras sufren apoptosis cuando se estimula P2X729. Estas respuestas opuestas en las NSC, las células tumorales y las neuronas maduras podrían explicarse hipotéticamente por la capacidad evolutivamente retenida de los mecanismos de reparación basados ​​en células, como la regeneración cerebral, observada en animales inferiores30. Descubrimos que la mayoría de las iNSC responden al ATP extracelular a través de P2X7. Además de la expresión de P2X7, sugerimos que las iNSC también expresan receptores P2Y mediante la observación de ondas de calcio intracelulares cuando las chispas de calcio mediadas por P2X7 fueron bloqueadas por el antagonista específico de P2X7 Brilliant Blue G21,22,23,24.

Los iNSC no son poblaciones homogéneas. El tratamiento con trifosfato de adenosina (ATP) da como resultado respuestas mixtas de chispas y ondas de calcio aleatorias con varios rangos dinámicos. Estudios anteriores han aplicado el método ML para analizar formas de onda como imágenes digitalizadas31 o como datos de series temporales unidimensionales32. Nuestra hipótesis es que el ML que utiliza imágenes de formas de onda sin procesar podría ser más eficaz para manejar los datos de formas de onda de alta variedad de las chispas de calcio. Sin embargo, el primer ensayo de ML que utilizó formas de onda únicas mostró resultados insatisfactorios. Planteamos la hipótesis de que la posible razón de esta falla es que ML podría verse muy afectado por las grandes desviaciones de los rangos dinámicos de la señal de los datos de forma de onda y decidimos probar ML usando imágenes compuestas con nueve formas de onda en una con el objetivo de diluir el efecto de dichas imágenes. Al comparar las dos metodologías de ML anteriores, descubrimos que el último método puede lograr una precisión de predicción mucho mejor, lo que sugiere que nuestra nueva estrategia de ML podría tener una ventaja al utilizar señales de forma de onda altamente variables.

El aprendizaje automático se ha aplicado con éxito a los ámbitos de las imágenes, incluido el campo médico, para ayudar en el diagnóstico mediante la detección de tejidos cancerosos en datos de imágenes y la distinción de cambios sutiles. En la mayoría de las aplicaciones en el dominio visual, los humanos pueden dar fe de las predicciones demostradas por el MLM. Por el contrario, los humanos no pueden clasificar las chispas de calcio detectadas en iNSC utilizando parámetros clásicos, incluida la frecuencia o el rango dinámico, lo que sugiere que nuestro MLM puede reconocer características no identificadas de las formas de onda. Para investigar este mecanismo, realizamos ML utilizando solo las formas de onda de señal débil seleccionadas. Descubrimos que solo el MLM desarrollado utilizando formas de onda compuestas de señal débil dio como resultado precisiones promedio inesperadamente mejores que el modelo desarrollado usando imágenes compuestas que incluyen formas de onda seleccionadas al azar. Esto podría deberse a que ML puede centrarse en diferencias esenciales cuando se reducen las desviaciones del rango dinámico en los datos de aprendizaje. Tenga en cuenta que incluso el uso de MLM de imágenes seleccionadas desarrollados por formas de onda únicas mostró una capacidad de predicción inferior, lo que destaca la sólida superioridad de nuestro "método compuesto de formas de onda". Finalmente, confirmamos que se obtuvieron capacidades de predicción similares de los MLM al usar el mismo número de formas de onda para los ML, lo que sugiere que la razón por la cual nuestro nuevo método ML puede extraer diferencias significativas en las formas de onda podría ser el refuerzo mediante un aprendizaje repetitivo efectivo mediante la reutilización de formas de onda. En contraste con los méritos anteriores, encontramos que la precisión de la predicción del "método compuesto de forma de onda" depende del lote de células, lo que significa que el aprendizaje de formas de onda y la prueba de formas de onda tratadas con sustancias deben obtenerse utilizando los mismos iNSC. Porque incluso cuando utilizamos dos veces las iNSC derivadas de las mismas poblaciones congeladas maestras, el MLM desarrollado utilizando una iNSC cultivada no fue efectivo para la predicción de las diferentes formas de onda derivadas de lotes de células. Esto podría deberse a que las diferencias sutiles en los iNSC podrían afectar el ML. Para minimizar las diferencias entre lotes en las iNSC, el uso de una máquina de cultivo automatizada podría ser una solución33. Además, nuestro método ML logró parcialmente la segregación correcta de sustancias no educadas, lo que sugiere que se necesitaría ML con conjuntos de datos de formas de onda más grandes para una previsibilidad más poderosa para las sustancias no educadas.

En un ejemplo similar, el ML tiene una discriminación de datos superior en comparación con los humanos. Por ejemplo, los modelos ML han podido detectar complejos ventriculares prematuros durante el ritmo sinusal, no durante la arritmia, y es difícil incluso para los médicos altamente capacitados predecir los complejos ventriculares prematuros durante los ritmos normales32. Los autores discutieron un posible mecanismo mediante el cual MLM puede detectar cambios estructurales sutiles en el ECG que subrayan los complejos ventriculares prematuros. En el estudio anterior, Chang et al. realizó ML convirtiendo datos de series temporales unidimensionales a partir de imágenes bidimensionales. Hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero en informar el desarrollo de un MLM de alta precisión para analizar alteraciones sutiles no identificadas desarrolladas con imágenes de formas de onda sin procesar con un alto grado de variabilidad.

Confirmamos que el pretratamiento tuvo un efecto característico sobre el perfil de expresión global del ARNm. Sin embargo, la expresión de los genes afectados fue muy baja, a excepción del ácido valproico. Sorprendentemente, nuestro MLM puede distinguir las características de la respuesta del calcio celular basándose en algunos de estos cambios genéticos. Por lo tanto, verificamos cuidadosamente la categorización de los cambios en la expresión genética basada en la ontología genética (GO) y encontramos que todos los miembros positivos del grupo mostraron cambios comunes en la expresión genética relacionados con la "actividad de transporte transmembrana pasiva" y la "actividad del canal", lo que sugiere que tales cambios en Las actividades transmembrana podrían ser las bases mecanísticas de los efectos neuronales dependientes de la dosis del compuesto probado que pueden ser detectados por nuestro MLM. El resultado anterior también enfatiza que el MLM desarrollado por nuestro nuevo método ML puede ser una herramienta poderosa para revelar las alteraciones internas ocultas de las iNSC por sustancias neuronales efectivas.

La línea 253G1 de células madre pluripotentes inducidas por humanos se obtuvo del Laboratorio de Estudios de Células Pluripotentes, Centro de Investigación RIKEN BioResource, ciudad de Tsukuba, Ibaragi, Japón.

Las hiPSC se mantuvieron en placas de plástico de 10 cm (Corning Inc., NY, EE. UU.) recubiertas con 0,5 μg/cm2 de iMatrix511 Silk (Nippi Inc., Tokio, Japón) con StemFit® AK02N (Ajinomoto, Tokio, Japón) como medio de cultivo. bajo atmósfera controlada a 37 °C, 5% de CO2 y > 95% de humedad. Las células que alcanzaron una confluencia del 70% al 90% se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato sin calcio (PBS(-); Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japón) y se trataron con 3 ml de enzima expresa TripLE™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con 10 μM del inhibidor de la Rho quinasa Y-27632 (Sellec Inc., Tokio, Japón) durante 15 minutos a 37 °C. El desprendimiento y la dispersión en células individuales se realizaron pipeteando usando pipetas de 10 ml con la adición de 5 ml de PBS (-) suplementado con fracción V de albúmina sérica bovina al 0, 15% (BSA: Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japón). Las células se recogieron en un tubo de 15 ml y se centrifugaron a 800 rpm (115 x g) durante 5 minutos para su deposición. Luego se aspiró el sobrenadante y el sedimento celular se dispersó en células individuales usando 10 ml de Stemfit suplementado con Y-27632 10 µM mediante pipeteo.

Para iniciar la diferenciación (día 1), se sembraron iPSC indiferenciadas a una densidad de 25.000 células/cm2 en una placa de 10 cm recubierta con Matrigel® diluido al 1/100 (Corning Inc.) con 10 ml de medio inductor neuroectodérmico que consistía en Dulbecco modificado. Medio Eagle (DMEM)/F12 (Fuji Film Wako Chemical Inc.) y medio Neurobasal (1:1; Thermo Fisher Scientific) suplementados con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, GlutaMAX® 1 mM (Thermo Fisher Scientific) con TGF-beta 10 μM inhibidor del receptor (SB431542), inhibidor de señal de BMP 10 μM (LDN-193189) y Y-27632 10 μM. Los cambios de medio se realizaron el día 3. En el día 5 de diferenciación, el medio se cambió a medio inductor neuroectodérmico suplementado con un 10% de reemplazo de suero Knockout (Thermo Fisher Scientific), 50 μg/ml de ácido ascórbico 2-fosfato (Merck), y 10 ng/ml de bFGF (Nacalai Tesque Inc.). Los cambios de medio se realizaron los días 7 y 8. En el día 9 de diferenciación, las células se pasaron para dividirlas en tres placas de 10 cm con 10 ml de medio de expansión iNSC que consistía en DMEM/F12 y medio neurobasal 1:1 suplementado con 0,1 mM no esencial. aminoácidos, GlutaMAX® 1 mM, suplemento de N-2 al 1 % (Thermo Fisher Scientific), suplemento de B-27 al 1 % (Thermo Fisher Scientific), reemplazo de suero Knockout al 10 % y bFGF 50 ng/ml. Los medios cambiaban a diario. Las células que alcanzaron el 100% de confluencia se pasaron nuevamente para su expansión. Las células resultantes se criopreservaron utilizando CELLBANKER-1 (Zenogen Pharma Co., Ltd., Fukushima, Japón).

Las iNSC criopreservadas se disolvieron y se sembraron en placas de 10 cm recubiertas con Matrigel® con 10 ml del medio de expansión de iNSC y se cultivaron en una incubadora hasta que alcanzaron confluencia. Después de lavar una vez con 10 ml de PBS(-), las células se separaron y disociaron usando 4 ml de TrypLE Express a 37 °C durante tres minutos. Las células se centrifugaron en un sedimento y luego se disociaron usando medio de expansión iNSC sin bFGF y varios pasos de pipeteo. La fracción 1/20 de las células recolectadas se sembró en una placa con fondo de vidrio recubierta de Matrigel (placa Cell Imaging de 170 μm, 35 mm, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Al día siguiente, el medio se reemplazó con 500 µl de medio de expansión iNSC sin bFGF que contenía las sustancias de prueba enumeradas en la Tabla 1. Luego, las células se trataron durante 12 a 16 h en una incubadora. Luego, el medio se reemplazó con 500 µl de medio de expansión iNSC precalentado sin bFGF que contenía Fluo4-AM (Biotium Inc., Fremont, CA, EE. UU.) y se incubó a 37 °C durante 30 minutos para cargar el tinte. Las células se lavaron con 500 µl de medio de expansión iNSC precalentado sin bFGF, y luego el medio se cambió con 500 µl de medio de expansión iNSC precalentado sin bFGF que contenía ATP 20 µM (Nacalai Tesque Inc.). Después del tratamiento con ATP, la fluorescencia celular aumentó rápidamente y disminuyó gradualmente en aproximadamente 200 s (Figura complementaria 8). Por lo tanto, el registro de las chispas de calcio se inició 200 s después de la adición de ATP. Posteriormente, grabamos secuencialmente durante 5 minutos en al menos tres campos de visión seleccionados al azar. Se tomaron imágenes de lapso de tiempo (512 × 512 píxeles) cada 1 s con un tiempo de exposición de 100 ms (Eclipse Ti2, Nikon Instruments, Tokio, Japón). Las imágenes obtenidas se exportaron como vídeo en formato intercalado de audio y vídeo (AVI) utilizando el software NIS Elements (Nikon Instruments). Para investigar el efecto de la inhibición de P2X7 sobre las chispas de calcio inducidas por ATP, se agregaron BBG 20 μM, JNJ-47965567 20 μM o AZD9056 10 μM al medio antes de la exposición a ATP.

Los videos de imágenes de calcio adquiridos se mejoraron con contraste, se suavizaron con el software ImageJ y se convirtieron a archivos multitiff en escala de grises. Para los datos convertidos, la caja de herramientas MATLAB publicada por Romano et al. se utilizó para rastrear cambios en la intensidad de la fluorescencia y convertirlos en datos de forma de onda34. Las regiones de interés (ROI) se establecieron mediante segmentación hexagonal con un diámetro de 20 μm. La escala de ruido de fluorescencia de referencia se estimó ajustándola a un modelo gaussiano. Las ROI que contienen picos se seleccionaron utilizando el modo de umbral "dinámica lenta y suave" del parámetro de la caja de herramientas. Los datos de forma de onda se crearon en el formato del Grupo Conjunto de Expertos en Fotografía. Se utilizaron datos de forma de onda para ML, ya sea una forma de onda como un punto de datos o un punto de datos que tiene una combinación de nueve imágenes de formas de onda seleccionadas al azar. Los ML se realizaron utilizando AutoML Vision en Google Could Platform (https://cloud.google.com/automl). AutoML Vision dividió aleatoriamente el 90 % del total para capacitación y validación y el 10 % para pruebas. La prueba de los datos intragrupo y los datos nuevos no experimentados del modelo ML (MLM) se realizó ingresando cada forma de onda en el MLM.

Las iNSC se trataron sin ninguno, con dosis bajas de cafeína como grupo negativo y con dosis altas de cafeína, ácido valproico y haloperidol como grupo positivo, como se describe en la sección de imágenes de calcio. El ARN total se extrajo con Isogen y se trató con ADNasa libre de ARNasa (QIAGEN, Venlo, Países Bajos). La construcción y secuenciación de la biblioteca fueron realizadas por Novogene Co. Ltd. (Beijing, China). Brevemente, el ARNm enriquecido se fragmentó aleatoriamente, seguido de la síntesis de ADNc utilizando una plantilla de ARNm y cebadores hexámeros aleatorios. Después de la síntesis de la segunda cadena, se realizó la ligadura del adaptador de secuenciación. Se desarrollaron bibliotecas de ADNc de doble cadena completas mediante selección de tamaño y enriquecimiento por PCR. Las bibliotecas de ARN se secuenciaron en un secuenciador HiSeq (Illumina). Los análisis bioinformáticos fueron realizados por Novogene Co., Ltd.

Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 5 minutos a 25 °C. Después de eso, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,2% (TBS-T) y se trataron con una solución de bloqueo (Nacalai Tesque) durante 30 minutos a 25 °C. El agente bloqueante que contenía el anticuerpo primario se añadió a las células y se incubó durante la noche a 4 °C con sellado de parafina para evitar la evaporación. Las células se lavaron tres veces con TBS-T y se sumergieron en el agente bloqueante que contenía anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las señales de fluorescencia se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Nikon Instruments, Tokio, Japón). Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 2.

Las NSC se lavaron una vez con PBS (-) y se lisaron usando tampón RIPA (Nacalai Tesque Inc.) con un cóctel inhibidor de proteasa (#08714, Nacalai Tesque Inc.). Realizamos electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio utilizando Bolt ™ Bis-Tris al 4-12% y un sistema Mini Protein Gel de 1,0 mm. Las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (n.º 1214726, GVS, SpA Roma, Italia) y se analizaron mediante transferencia Western. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 1. La señal luminiscente se obtuvo utilizando un sustrato de peroxidasa de rábano picante (Amersham™ ECL™ Prime, Cytiva, Tokio, Japón) y se capturó utilizando Fusion Solo-S (Vilber, Collégien, Francia) . Como control interno, detectamos la proteína beta-actina utilizando la misma membrana reprobada después del tratamiento con solución de extracción (Fuji Film Wako Chemical Inc.).

El ARN total se extrajo de las células utilizando ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japón) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa de 500 ng de ARN total se realizó utilizando un kit de síntesis de ADNc Versa (Thermo Fisher Scientific). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa se realizó utilizando Thunderbird® Next SYBR® qPCR Mix (Toyobo, Co. Ltd., Osaka, Japón) con conjuntos de cebadores específicos de genes para nestina y ARNm de p2 × 7. Todos los experimentos se realizaron utilizando tres muestras independientes. Todos los niveles de expresión génica se normalizaron a los niveles de expresión del ARN de la proteína ribosómica interna S18. Las secuencias del par de cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 3.

Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student no apareada utilizando el software Microsoft Excel. La significación estadística se estableció en P <0,05.

Los datos de secuenciación de ARNm sin procesar están disponibles en el Banco de datos de ADN de Japón (DDBJ, número de acceso al Bio Project: PRJDB15077). Las demás contribuciones originales presentadas en este estudio se incluyen en el artículo y en los materiales complementarios, y cualquier consulta adicional puede dirigirse al autor correspondiente.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Ray Yueh Ku y al Dr. Kazue Hashimoto-Torii del Centro Médico Nacional Infantil, Washington, DC, EE. UU., por su asistencia técnica. La comunicación personal con el Dr. Kazue Hashimoto-Torii dio como resultado una parte importante de los conceptos básicos de este estudio.

Suntory Holdings Co., Ltd. proporcionó una subvención de investigación colaborativa.

Estos autores contribuyeron por igual: Yuki Hanafusa y Fumiyuki Hattori.

Medicina Regenerativa Innovadora, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad Médica de Kansai, Osaka, Japón

Yuki Hanafusa y Fumiyuki Hattori

División de Garantía de Calidad del Grupo, Instituto de Ciencias de la Seguridad, Suntory Holdings Ltd., Tokio, Japón

Yuki Hanafusa

División de Función Biomolecular Integrativa, Instituto de Investigación Bioorgánica, Fundación Suntory para Ciencias de la Vida, Kioto, Japón

Akira Shiraishi

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YH y FH contribuyeron igualmente al estudio. YH y FH desarrollaron el concepto y diseño del estudio. FH realizó trabajos de laboratorio para obtener los datos. YH y AS realizaron procesamiento de datos y aprendizaje automático. YH y FH escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Fumiyuki Hattori.

YH, AS, FH no declaran tener intereses financieros en conflicto. YH es empleado de Suntory Holdings Co., Ltd. Este estudio fue financiado por Suntory Holdings Co., Ltd. El financiador no participó en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis, la interpretación de los datos, la redacción de este artículo ni la decisión. para enviarlo para su publicación.

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Reimpresiones y permisos

Hanafusa, Y., Shiraishi, A. y Hattori, F. El aprendizaje automático discrimina las chispas de calcio intracelular mediadas por P2X7 en células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Informe científico 13, 12673 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39846-4

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Recibido: 31 de enero de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39846-4

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